摘 要： 斑馬魚為一種硬骨淡水魚,其胚胎透明、發育和繁殖快,且70%以上的基因與人類相同。目前廣泛地應用于遺傳、發育、毒理、環境污染以及藥物篩選等方面的研究。本文歸納整理斑馬魚血液系統常用的實驗技術和檢測方法,同時介紹與斑馬魚血液系統研究相關的常用斑馬魚轉基因品系,以期為本領域的研究提供參考,促進斑馬魚在生命科學領域的應用。
關鍵詞： 斑馬魚; 血液系統; 應用;
Abstract： Zebrafish is a bony freshwater fish,its embryo is transparent,develops and reproduces quickly,and more than 87% of its genes are the same as humans.At present,it is widely used in the research of genetics,development,toxicology and environmental pollution,and drug screening.This article summarizes the commonly used experimental techniques and detection methods of the zebrafish blood system.The available transgenic lines of zebrafish have been utilized to the study of the hematological system,which provide references for the research in and promote the application of zebrafish in the field of life science.
Keyword： zebrafish; hematological system; application;
斑馬魚是一種微小的熱帶硬骨魚，最早用于發育和遺傳學研究，近年在生命科學和醫藥領域的研究中取得了廣泛的關注和應用。斑馬魚繁殖力強，養殖成本低，遺傳資源豐富，易于轉基因品系的開發，適于中量篩選，是基礎和應用生物醫學研究的重要模式生物。通過對斑馬魚和人類參考基因組的比較發現，70%以上的人類基因至少有一個明顯的斑馬魚同源基因與之對應[1]。斑馬魚也是研究血液系統和造血功能非常適合的模型，斑馬魚幼魚身體透明可以清楚地看到血液流動和心臟跳動，應用原位雜交技術，固藍染色等技術可視化地觀察血液細胞和造血相關基因的表達，同時斑馬魚轉基因品系資源豐富，可以用于對血液系統和造血功能的研究。下文將對常用的研究方法和實驗技術進行介紹。
1 、流式細胞術分析血液系統
1.1 、流式分析斑馬魚腎髓細胞群
流式細胞術前向角散射光(Forward Scatter,FSC)與細胞大小有關，側向角散射光(Side Scatter,SSC)與細胞內部的精細結構和顆粒性質有關。成年斑馬魚的腎髓相當于哺乳動物的骨髓，是造血器官。利用FSC和SSC參數對斑馬魚的腎髓細胞進行分群，可觀察到明顯的5群。成熟的紅細胞處于FSC低象限，髓系單核細胞(myelomonocytic cells)群中包括中性粒細胞(neutrophils，又稱嗜異質粒細胞heterophilic granulocytes)、單核細胞(monocytes)、巨噬細胞(macrophages)和嗜酸性粒細胞(eosinophils，又稱嗜酸堿粒細胞eo/basophils)，處在FSC高、SSC高象限細胞群中;淋巴細胞群(lymphoid cells)位于FSC中間、SSC低象限;未成熟的前體細胞位于FSC中間、SSC低象限;成熟的紅細胞處于FSC低象限，沿SSC象限明顯地分為兩群，以分選后的其中一群細胞再進行流式檢測仍可得到與原來相似的兩群細胞，這可能是因為紅細胞為橢圓形的緣故。利用微球對細胞平均大小進行測量，各群細胞的大小分別為髓系單核細胞15.2μm;前體細胞13.8μm;淋巴細胞8.3μm;紅細胞6.2μm[2]。
1.2 、電離輻射對斑馬魚造血功能的損傷
電離輻射可引起放射病，呈現機體的全身性反應，幾乎所有器官、系統均發生不同程度的病理改變，而人體的血液系統、神經系統、消化系統和生殖系統對損傷最為敏感。根據電離輻射對人體造成損害的方式，可以分為直接作用和間接作用兩種途徑，直接作用是輻射的能量累積在DNA、蛋白質、酶類、脂類、MicroRNA等生物大分子上引起電離和激發，使化學鍵斷裂、分子變性和細胞結構破壞[3]。而間接作用是電離輻射作用于有機體內的水分子，并使其電離產生大量的自由基攻擊體內的大分子物質如DNA、蛋白質等，進一步導致細胞的結構改變和功能損傷，造成細胞的氧化損傷[4]。因為血液細胞和造血組織對于電離輻射的敏感度高[5]，受到電離輻射后人體的血液系統的細胞最先發生形態結構上的變化，隨之功能受到影響。
David[6]等，研究了電離輻射對斑馬魚腎髓細胞的影響。他們給予成年斑馬魚20 Gy的電離輻射照射，在1、4、8、10、14、30 d利用FSC和SSC分群，觀察腎髓中紅細胞、髓系單核細胞、前體細胞和淋巴細胞比例的變化和總數量的變化，發現輻射后紅細胞的占比快速從50%左右增加到70%左右，在輻射后第4、7、10、14、30 d，隨著時間的延長占比逐漸減少;而髓系單核細胞、前體細胞和淋巴細胞三群細胞的占比在電離輻射后1～8 d逐漸減少，8 d之后細胞的比例逐漸增加，表明造血能力增強，到第30 d，三群細胞逐漸恢復，甚至超過電離輻射前的水平，特別是前體細胞大量增殖。而各群細胞的總數量也經歷了從減少到增加的過程。
觀察斑馬魚電離輻射后腎髓細胞的整個動態變化過程可知，髓系單核細胞、前體細胞和淋巴細胞對電離輻射十分敏感，電離輻射后細胞占比急劇下降，而輻射對紅細胞的影響相對較小。在電離輻射第30 d，因輻射損傷死亡的細胞數量逐漸被新生細胞所補充，甚至高于電離輻射前的水平。
1.3、 造血活性物質篩選
North[7]等研究了一系列生物活性化合物對電離輻射后的成年斑馬魚腎髓造血的影響。在斑馬魚受到23 Gy輻射后第2 d，給予不同濃度的生物活性化合物，利用FSC和SSC進行細胞分群，分別在藥物處理后的第4、7、10、14 d觀察腎髓紅細胞、髓系單核細胞、前體細胞和淋巴細胞比例的變化，實驗發現腎髓前體細胞的升高明顯，繼而髓系單核細胞、淋巴細胞和紅細胞逐漸升高，表明前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)可以促進輻射后受損傷的造血功能的恢復。
2 、固藍染色幼魚紅細胞
2.1、 紅細胞數量檢測
紅細胞包含許多類似于肝臟和其他組織中催化異源代謝的酶，因此可以催化典型的單加氧酶反應，包括O-和N-去甲基化以及芳族和脂肪族羥基化等，血紅蛋白在聯苯茴香胺和過氧化氫的體系中可以催化其反應在血紅蛋白表面形成鐵銹色沉淀，沉淀的面積和顏色的深淺可以用來指示斑馬魚體內血紅蛋白的含量，進一步反映紅細胞的數量，可用來判斷處理因素對紅細胞的影響[8]。
2.2、 藥物篩選
Manali[9]等用0.5μg/m L苯肼處理33 hpf(hours past fertilization)斑馬魚幼魚，造成斑馬魚幼魚溶血性貧血，在54 hpf～96 hpf給予不同的小分子藥物處理后進行固藍染色，分析尾部造血組織(Caudal Hematopoietic Tissue,CHT)的平均光密度值，以指示CHT紅細胞的多少，從而篩選對于溶血性貧血有保護作用的小分子化合物。
3、 熒光實時定量PCR檢測mRNA表達
3.1 、實時熒光定量PCR技術
實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質監測每次聚合酶鏈式反應循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對樣品中的特定DNA序列的表達量進行定量分析[10]。從斑馬魚組織中提取RNA，將其轉錄為c DNA，利用qRT-PCR方法測定c DNA的含量，從而完成對斑馬魚特定mRNA含量的測定，從mRNA的含量推斷特定DNA序列的表達變化。
3.2 、造血轉錄因子的檢測
Kasem[14]等研究了一個斑馬魚的貧血模型。他們將幼年斑馬魚進行兩周的17℃低溫培育，后正常26.5℃飼養1個月，未進行低溫處理的斑馬魚作為對照組。取斑馬魚的腎髓提取RNA，進行qRT-PCR檢測，發現編碼造血轉錄因子(Runx1、scl、cmyb和gata2)，特別是促紅細胞生成素相關因子(klfd、hbaa1、ba1、gata1、EPO和EPOr)的表達上調，而髓系造血相關因子(csf1a和csf3)在低溫條件下調。
Paffett-Lugassy[12]等通過qRT-PCR對不同發育階段的斑馬魚的EPO的表達進行了研究發現，32hpf細胞期至24 hpf檢測到EPO的低表達，而在36 hpf處出現一個微小的表達峰，此后表達水平不變，直到8～14 dpf其表達迅速增加。在成年魚體中，EPO轉錄本可在心臟高表達，在大腦、肝臟和腎臟表達較低，在脾和大腸沒有表達。斑馬魚發育過程和組織EPO的變化規律與哺乳動物十分相似，從而證明斑馬魚的造血功能與哺乳動物相似，表明在脊椎動物中造血調控具有高度保守性。
4 、原位雜交技術檢測mRNA表達
4.1 、原位雜交技術
在斑馬魚中使用全原位雜交(Whole-Mount In Situ Hybridization,WISH)技術已經有幾十年的歷史。斑馬魚幼體是光學透明的，使得對RNA的表達進行定位化、可視化觀察很容易，特別是對特定時期的RNA的表達進行定量觀察[13]。在原位雜交技術中，需要一個特定標記的反義核酸探針按照堿基互補配對的原則與原始細胞或組織中的核酸進行雜交，形成雜交體，雜交體經過顯色反應可以在顯微鏡下觀察其細胞或組織中的RNA，顏色的深淺表示RNA表達的高低，從而實現定量和定位[14]的觀察。
4.2 、藥物篩選
North[7]等利用原位雜交技術研究了幾個代表性的前列腺素激動劑和拮抗劑對3 hpf斑馬魚胚胎的造血干細胞的影響，發現inoleic acid增加了runx1+/myb+干細胞的數量，celecoxib減少了這類干細胞的數量。
5 、轉基因斑馬魚
轉基因技術的核心是將人工分離或修飾過的基因有目的性地導入到生物體基因組中，使得該基因表達，且該基因和其造成的性狀改變可以遺傳給下一代。在斑馬魚中進行轉基因技術的應用實際上是通過顯微注射技術，將外源基因通過注射導入斑馬魚受精卵中，再通過基因組篩選獲得穩定遺傳外源基因的品系[15,16]。在轉基因斑馬魚模型中，尤其值得注意的是表達熒光蛋白的品系，由于斑馬魚幼魚魚體透明，非常易于在顯微鏡下觀察。表達熒光蛋白轉基因斑馬魚品系已被用于藥物發現篩選、安全性評估、發育生物學和環境毒理學等諸多研究領域。而不同血液細胞的特異轉錄因子或蛋白進行標記的熒光蛋白的品系，對于研究血液細胞的特化以及病理生理的變化非常重要，下面介紹幾種常見的表達熒光蛋白的轉基因斑馬魚品系。
5.1 、紅系細胞轉基因斑馬魚品系
gata1也稱紅系轉錄因子1，是gata轉錄因子家族成員，在紅系細胞分化過程中起著至關重要的調控作用。在斑馬魚紅系細胞的發育過程中，紅細胞和紅系骨髓祖細胞(erythromyeloid progenitor,EMP)等紅系相關細胞高表達gata1，所以在斑馬魚中gata1是紅系細胞特化和維持的關鍵的調節因子[17]。在Tg(gata1:dsRed)轉基因的斑馬魚胚胎中用熒光顯微鏡觀察斑馬魚胚胎紅系細胞會表達特異性紅色熒光。
Ferri-Lagneau[18]等利用Tg(gata1:dsRed)轉基因斑馬魚胚胎，研究了生姜提取物對體內造血的影響，確認了生姜提取物促進了gata1在紅系細胞中的表達，增加了造血祖細胞標志物cmyb和scl的表達。進一步研究發現生姜提取物能通過增加表達gata1紅系細胞數量，促進苯肼所導致的斑馬魚急性溶血性貧血的造血功能恢復。
Tg(gata1:dsRed)轉基因斑馬魚標記的是紅系的細胞群體，而其中包括紅細胞、紅系骨髓祖細胞、不成熟的早幼紅細胞、中幼紅細胞等[2]。對紅細胞不同發育階段的精細調控需要更多的階段特征性標志物進行標記。
Lenard[19]等將Tg(gata1:dsRed)和Tg(globin:GFP)的兩個品系進行交配，形成具有雙色熒光的轉基因斑馬魚品系。其中globin是在紅細胞中特異表達的蛋白，通過共定位圖片可以清楚地觀察到成熟的紅細胞高表達gata1和globin，成功地將紅細胞從紅系細胞中區分出來。通過流式的紅色和綠色熒光通道進行分群，也可以將紅細胞從紅系細胞中分離出來形成兩群。
Bertrand[20]等利用流式對Tg(gata1:dsRed)和Tg(lmo2:e GFP)共表達的24-48 hpf的斑馬魚胚胎中同時高表達lmo2和gata-1的細胞群進行分選。對分選后的細胞的基因表達進行研究，發現該群細胞是同時具有髓系和紅系的特征，該群細胞并非成熟的紅細胞而屬于EMP。
5.2、 髓系細胞轉基因斑馬魚品系
斑馬魚中性粒細胞可以特異性的表達髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO),MPO高表達可作為鑒定斑馬魚中性粒細胞的標志。早在18 hpf胚胎，就可以在中間細胞群檢測到斑馬魚MPO mRNA的表達，在3 dpf(days post fertilization)，循環血細胞中也可以檢測到MPO的表達。Mathias[21]等成功構建了Tg(mpx:GFP)斑馬魚轉基因品系，并利用該品系研究炎癥反應下斑馬魚中性粒細胞的趨向性。當組織損傷時引起強烈的炎癥反應，其特征是中性粒細胞迅速向傷口部位聚集。使用體內延時成像觀察斑馬魚，可見炎癥誘發后中性粒細胞隨即表現為從血管系統向外的逆向趨化。
斑馬魚幼魚時期溶菌酶C是由從髓系細胞分化而來的巨噬細胞和中性粒細胞產生的，所以Hall[22]等將綠色熒光蛋白轉入斑馬魚溶菌酶C基因的啟動子構建了Tg(lyz:e GFP)斑馬魚品系，該品系可以標記部分巨噬細胞和中性粒細胞。
在上文介紹的斑馬魚轉基因品系Tg(mpx:e GFP)中，表達熒光信號高的一群細胞為中性粒細胞，熒光信號較低的細胞亞群，其結構特征是巨噬細胞。Lawson[23]等構建的Tg(fli1a:e GFP)斑馬魚轉基因品系被用來研究胚胎損傷的原始巨噬細胞的行為，但fli1a在原始白細胞和內皮細胞中均有表達，所以此品系特異性較差。
為解決這一問題，Ellett[24]等利用巨噬細胞特異性標記物mpeg1構建斑馬魚轉基因品系Tg(mpeg1:e GFP),mpeg1最初被認為是一個在人類和小鼠巨噬細胞中特異表達的基因，隨后被廣泛地用于哺乳動物和斑馬魚中標記巨噬細胞，mpeg1轉基因品系的中性粒細胞不被標記，從而成功區分了中性粒細胞和巨噬細胞。他們利用這一品系的斑馬魚，比較了中性粒細胞和巨噬細胞損傷后的不同動態行為及其相互作用，這為炎癥、感染和白細胞生物學等領域提供了新的研究資源。
斑馬魚作為一種新型的模式動物，與傳統的小鼠、大鼠模型相比具有諸多優勢，特別是其可視化、高通量、給藥量小、遺傳背景清楚等特點，非常適合研究血液系統的發育、損傷和修復，為這一領域提供了一個新穎實用的動物模型。同時流式細胞技術、原位雜交技術、實時熒光定量PCR和固藍染色在斑馬魚模型的應用，以及越來越多斑馬魚轉基因品系的應用，為研究血液系統的研究提供了有力的支持。
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